蛋白印跡實驗封閉蛋白選哪種，牛奶或 BSA？
蛋白印跡實驗封閉蛋白選哪種，牛奶或 BSA？
脫脂奶粉或牛血清白蛋白 (BSA) 會如何影響你的蛋白印跡結(jié)果。
關于蛋白印跡 WB 實驗，我們常遇到一個問題，我該用什么來封閉，牛奶或 BSA？
首先，我們需要了解封閉的目的：減少因非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景。其次，我們需要知道 BSA 和牛奶的區(qū)別：BSA 僅由一種蛋白組成，即 60 kDa 的牛血清白蛋白；而牛奶則由許多大小不一的蛋白構成。
所以，CST (Cell Signaling Technology) 推薦牛奶封閉最佳，因為牛奶有更大的機會來減少更多的非特異性結(jié)合。我們建議您用經(jīng) TBST 稀釋的 5% 牛奶，在室溫下?lián)u晃一小時，來封閉CST所有非偶聯(lián)一抗，這包括磷酸化特異性和總抗體。
現(xiàn)在，曾有同學問過，“牛奶中的磷酸酶會怎么樣？” 或許有一些文章反對使用牛奶來檢測磷酸化信號，這一誤區(qū)的出現(xiàn)可能是由于實驗者使用了非實驗級奶粉引起的（國內(nèi)許多奶粉含有磷酸酶等雜質(zhì)），但在 CST 的所有內(nèi)部檢測中，科學家們進行了多次蛋白印跡實驗，從未發(fā)現(xiàn)任何這樣的問題。CST建議轉(zhuǎn)膜后迅速在TBS中洗滌膜幾秒，以便移除殘留的轉(zhuǎn)膜緩沖液，隨后使用5%脫脂牛奶（請使用實驗級的#9999）的TBST室溫封閉1h。另外，CST科學家們每天至少要新鮮配制一次牛奶，有時甚至一天配制多次，因為如果牛奶緩沖液放置了一周、兩周甚至更長時間不使用，那么磷酸酶影響信號的機率將會增加。
上圖是(Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP??Rabbit mAb)?#13038 用來檢測經(jīng) PDGF 處理的 3T3 細胞裂解物的結(jié)果圖片。左側(cè)膜是用牛奶封閉，右側(cè)膜用 BSA 封閉。顯然，用 BSA 封閉的膜的背景更高。但用牛奶封閉膜時，磷酸化信號仍然很強且清晰。
封閉后，請仔細查看一抗的說明書，根據(jù)推薦的一抗緩沖液來稀釋一抗，一般推薦牛奶或 BSA，但取決于不同抗體。
希望本篇講述的實驗細節(jié)對您的實驗有所幫助。全部特定應用的實驗步驟可在 cst-c.com.cn 具體產(chǎn)品頁上找到。如果你有任何其他技術問題，請郵件聯(lián)系tech@cst-c.com.cn，或可撥打全國免費技術熱線：4006-GreatQ（473287）。
本來來自 CST中國 CST博士互助平臺
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