單細胞測序后的RNAscope驗證實例——2019年代表性文章解讀
單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術作為一項革命性工具，在單細胞水平上對轉錄組進行分析，已經被廣泛用于多個方面的生物醫學研究，包括腫瘤異質性研究、新細胞類型的鑒定、組織發育與細胞分化過程研究和基因調控網絡研究等。通過scRNA-seq獲得高通量的單細胞轉錄組數據后，利用原位組織學驗證是目前流行的研究策略，也是對單細胞測序結果篩選出的有價值分子的空間分布定位回溯以及結果真實性的驗證。
由于這其中的很多原位待檢測分子屬于新發現的靶點，缺乏有效的免疫組化抗體；也存在一些例如GPCR,離子通道這類無法制備免疫組化抗體的靶點；而對于分泌型細胞因子由于其合成后被第一時間排出到細胞外，故無法通過免疫組化方式定位分泌細胞；包括長鏈非編碼RNA在內的一些靶點則不可能使用免疫組化的原位檢測方法進行靶點追蹤。對于以上的這些分子的原位檢測，目前通常使用RNAscope技術進行解決。RNAscope技術以其具有高度敏感性和特異性、單分子可視化、多通道靶點同時檢測（在一張切片上同時檢測12個靶點）等特有的優勢，已經廣泛應用于原位驗證單細胞轉錄組學的結果。本文將以2019年使用RNAscope技術驗證單細胞轉錄組學結果發表的一些代表性文章為例為大家介紹相關研究進展。
2019年來自麻省理工學院和哈佛大學的研究學者在《Cell》雜志上發表的一篇研究論文揭示了潰瘍性結腸炎的耐藥機制[1]。在這項研究中，研究人員利用scRNA-seq從18例潰瘍性結腸炎（UC）患者和12例健康人的結腸粘膜中生成了366，650個細胞的圖譜，以此來了解細胞類型特異性和作用途徑，揭示了51個上皮細胞、基質細胞和免疫細胞亞群。在UC患者中，腫瘤壞死因子(TNF)蛋白水平較高，抗TNF藥物可減輕炎癥并治愈許多患者的組織。然而，大約30%的患者對治療沒有響應，而那些有響應的患者隨著時間的推移變得具有耐藥性。研究人員此前已經確定了耐藥性相關的基因，但尚不清楚結腸中哪些特定的細胞類型表達了這些基因。在此次研究中，單細胞測序數據分析表明BEST4 +腸上皮細胞，RSPO3+成纖維細胞，IL13RA2 + IL11 +炎性成纖維細胞等細胞亞群與抗腫瘤壞死因子（TNF）治療的抗性有關。研究人員進一步利用RNAscope原位雜交結合免疫熒光驗證并從空間定位上展現了單細胞測序的主要發現。下圖為使用RNAscope檢測到的健康人BEST4 +腸上皮細胞（左圖，紅色表示RNAscope檢測到的BEST4的RNA信號）與RSPO3+成纖維細胞（右圖，紅色表示RNAscope檢測到的RSPO3的RNA信號）在腸道中的定位情況。
盡管大多數成纖維細胞亞群同時存在于健康個體和UC患者中，但一類稱之為炎癥相關成纖維細胞（IAFs）的亞群在一些病人的炎癥組織中表達擴大了189倍。IAFs富含許多與結腸炎、纖維化和癌癥相關的基因，包括IL11、IL24和IL13RA2。研究人員就利用RNAscope原位雜交技術檢測了健康組織與炎癥組織中的炎癥相關成纖維細胞的特征基因表達，證實了表達IL13RA2的炎癥相關成纖維細胞在炎癥組織中的表達遠高于正常組織（見下圖，紅色為RNAscope檢測到的IL13RA2的RNA信號）。
除了炎癥相關成纖維細胞外，單細胞測序分析結果也表明在UC患者樣本中，同時表達CD8和IL-17的T細胞所占比例更高。在進一步的RNAscope原位雜交驗證中發現CD4+與CD4- T細胞都共表達CD8與IL17A（見下圖，紅色為RNAscope檢測到的IL17A的RNA信號）。其中CD4+ CD8+IL17A+ T細胞是一類新發現的細胞亞群，在炎癥組織中，CD4+ CD8+IL17A+ T細胞的數量明顯增加。
腫瘤壞死因子（TNF）的表達在UC患者中發生改變，Treg細胞從健康組織向炎癥組織擴展，是炎癥過程中TNF的主要來源。在炎癥組織中，TNF在Treg細胞中誘導表達。研究人員利用RNAscope原位雜交檢測了IL10，TNFA以及Treg細胞標志基因FOXP3的表達，驗證了在炎癥組織中Treg細胞中TNF的表達顯著上升（見下圖，白色為RNAscope檢測到的FOXP3的RNA信號，綠色為RNAscope檢測到的IL10的RNA信號，紅色為RNAscope檢測到的TNFA的RNA信號）。
反復肝損傷導致進行性纖維化，破壞肝臟結構，再生潛能以及肝功能。肝星狀細胞（HSCs）是纖維化過程中病理基質的主要來源。2019年英國愛丁堡大學Dobie等人在《Cell Reports》發表的一篇研究論文將健康小鼠與肝纖維化小鼠的肝間質細胞進行單細胞測序分析，揭示了肝小葉中HSCs的空間和功能分區，鑒定了兩種有獨特基因表達特征的不同HSCs細胞亞群[2]，一種稱為門靜脈相關HSCs（PaHSCs），另一種稱為中央靜脈相關HSCs（CaHSCs）。為了確定這兩種HSCs亞群的空間分布，研究人員進一步利用RNAscope原位雜交技術檢測了PaHSCs的標志基因NGFR與CaHSCs的標志基因Adamtsl2的表達（見下圖，左圖紅色為RNAscope檢測到的NGFR的RNA信號，右圖紅色為RNAscope檢測到的Adamtsl2的RNA信號）。通過與免疫熒光技術結合，證實了肝小葉中NGFR+ HSCs與門靜脈相關肝細胞（E-cadherin+）共定位，而Adamtsl2+ HSCs與中央靜脈相關肝細胞（Cyp2e1+）共定位。
急性CCL4誘導的肝損傷的特征是HSCs顯著增值以及被激活為肝小葉中心區域產生膠原的肌成纖維細胞。為了進一步研究PaHSCs和CaHSCs分化為致病性膠原產生細胞的動態，研究人員利用單細胞測序分析了急性CCL4誘導的肝損傷小鼠模型的HSCs。結果表明PaHSCs和CaHSCs兩個細胞亞群均表達細胞增殖標志物ki67，而只有CaHSCs中纖維化相關的基因表達顯著升高。利用RNAscope原位雜交結合免疫熒光證實了CaHSCs是在肝小葉中心性損傷導致的纖維化過程中產生病原膠質的主要細胞（見下圖，左圖紅色為RNAscope檢測到的NGFR的RNA信號，右圖紅色為RNAscope檢測到的Adamtsl2的RNA信號）。
年齡相關性黃斑變性（AMD）是致盲的主要原因之一，然而，由于該疾病的遺傳復雜性，使得確定與AMD相關的細胞類型一直是一個挑戰。2019年來自麻省理工學院，哈佛大學與劍橋大學的研究人員發表在《Nature Communication》上的一篇研究論文對人視網膜進行了單細胞測序分析，報告了人類視網膜的第一個單細胞轉錄圖譜[3]。通過對scRNA-seq數據進行分析，研究人員確定了所有主要的視網膜細胞類型，以及它們相應的基因表達特征。研究人員通過scRNA-seq首先鑒定了3種不同的大膠質細胞亞群，表明人類視網膜神經膠質比以前認為的要多樣化。3種大膠質細胞亞群分別特異性表達FOS，FTL, COL4A3。研究人員進一步使用RNAscope原位雜交技術驗證并確定了新鑒定的3種大膠質細胞亞群的空間分布（見下圖，A圖紅色為RNAscope檢測到的FOS的RNA信號，黃色為RNAscope檢測到的FTL的RNA信號；B圖紅色為RNAscope檢測到的COL4A3的RNA信號，黃色為RNAscope檢測到的FTL的RNA信號；C圖紅色為RNAscope檢測到的COL4A3的RNA信號，黃色為RNAscope檢測到的FOS的RNA信號）。
研究人員獲得的人視網膜單細胞轉錄組圖譜將AMD遺傳風險與細胞類型特異性表達模式相關聯，發現Müller膠質細胞和星形膠質細胞特異表達AMD相關基因，包括CFI, TIMP3, VEGFA與COL4A3。研究人員進一步使用RNAscope技術結合免疫熒光原位驗證了在Müller膠質細胞和星形膠質細胞中表達的AMD相關基因（見下圖，A圖紅色為RNAscope檢測到的CFI的RNA信號，B圖紅色為RNAscope檢測到的TIMP3的RNA信號；黃色為RNAscope檢測到的Müller膠質細胞標志物APOE的RNA信號）。該部分結果為黃斑變性的分子機制研究提供了原位空間細胞分布信息。
迷走神經感覺神經元是控制器官功能所必需的，但目前對所涉及的神經元類型的復雜性仍缺乏了解。2019年來自瑞典卡羅林斯卡研究所的研究人員通過scRNA-seq對頸靜脈和結節性迷走神經節的神經元類型進行了全面的鑒定和分類，鑒定出6種頸靜脈神經元和18種節狀神經元[4]。小鼠迷走神經神經節復合體包括神經嵴衍生的頸靜脈神經節和基板來源的節狀神經節，轉錄因子Phox2b可作為節狀神經元的標志物，另一種轉錄因子Prdm12可作為頸靜脈神經元的標志物。在此研究中，單細胞測序鑒定的24個迷走神經節神經元細胞群中有18個表達Phox2b，其余6個表達Prdm12。研究人員使用RNAscope技術進一步地量化分析了分別表達Phox2b與Prdm12的神經元的相對比例（見下圖，紅色為RNAscope檢測到的Phox2b的RNA信號，綠色為RNAscope檢測到的Prdm12的RNA信號），結果表明在469個神經元中，386個表達Phox2b，83個表達Prdm12。與單細胞測序結果一致，表明迷走神經神經節復合體由約85%的節狀神經元與約15%的頸靜脈神經元組成。
scRNA-seq鑒定的6種頸靜脈神經元分別命名為JG1-JG6。6種頸靜脈神經元分別有相應的特異性表達基因，JG1為Wfdc2，JG2為Mrgprd，JG3為Osmr，JG4為Kit，JG5為Nefh，JG6為Foxp2。為了證實這6種頸靜脈神經元在體內的分布，研究人員用RNAscope多重熒光原位雜交進行了驗證，針對不同的神經元亞群，分別設計了兩種探針，一種是每個神經元亞群對應的特異性表達基因，一種是頸靜脈神經元標志基因Prdm12，兩種探針聯合使用，原位鑒定6種不同的頸靜脈神經元（見下圖，RNAscope檢測到的Wfdc2，Osmr，Kit，Nefh的RNA信號為綠色，RNAscope檢測到的Mrgprd，Foxp2的RNA信號為紅色，白色為RNAscope檢測到的Prdm12的RNA信號）。
scRNA-seq鑒定的18種節狀神經元分別命名為NG1-NG18，所有節狀神經元類型都有獨特的基因表達模式。研究人員用RNAscope原位雜交的方法檢測18種節狀神經元的特征基因以及所有節狀神經元的共同標志基因Phox2b的表達，從空間定位上鑒定了18種不同的節狀神經元類型（見下圖，白色為RNAscope檢測到的Phox2b的RNA信號，綠色和紅色分別為RNAscope檢測到的18種節狀神經元的特征基因的RNA信號）。從而對測序結果進行了細胞和原位空間分布的驗證。
References
1. Christopher S Smillie, Moshe Biton, Jose Ordovas-Montanes, et al. Intra- And Inter-cellular Rewiring of the Human Colon During Ulcerative Colitis. Cell. 2019; 178(3):714-730.
2. Ross Dobie, John R Wilson-Kanamori, Beth E P Henderson, et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Zonation of Function in the Mesenchyme During Liver Fibrosis. Cell Rep. 2019; 29(7):1832-1847.
3. Madhvi Menon, Shahin Mohammadi, Jose Davila-Velderrain, et al. Single-cell Transcriptomic Atlas of the Human Retina Identifies Cell Types Associated With Age-Related Macular Degeneration. Nat Commun. 2019; 10(1):4902.
4. Jussi Kupari, Martin H?ring, Eneritz Agirre, et al. An Atlas of Vagal Sensory Neurons and Their Molecular Specialization. Cell Rep. 2019; 27(8):2508-2523.
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