酶的存活性              

長時間反應時，內切酶的活性保持情況因酶而異。

+ + + 酶活性時間 ＞ 8 小時

+ +     酶活性時間 4-8 小時

+        酶活性時間 2-4 小時

–      不建議反應時間 ＞ 1 小時

大多數限制性內切酶常規酶切時間為 1 小時或更短。某些反應要求加入酶量 ＜ 1 單位/μg DNA 同時相應延長反應時間 ＞ 1 小時。下表可做為低酶量或反應時間延長時的操作指南。 

例如，1 單位 AatII 能在 16 小時溫育后消化 8 μg DNA（+++）。

根據內切酶單位定義檢測延時酶切活性，其中標準的 1 小時反應時間改為 16 小時。表中標注有“+++”的酶是能延時酶切的內切酶，這些酶 16 小時酶切 1 μg DNA 僅需 0.13 單位的酶量；表中標注有“++/+” 的酶是具有中等活性的延時內切酶，16 小時完全酶切 1 μg DNA 需要 0.25（++）或 0.50（+）單位的酶量；標注有“-”的酶，需要 1 單位才能達到完全酶切，與 1 小時反應時間需要的酶量一樣。

超螺旋 DNA 的切割                

限制性內切酶對不同底物 DNA 切割效率不同。在標準反應條件下用質粒 pBR322、pUC19 和 pLITMUS 檢測內切酶切割超螺旋質粒的能力。盡量先用每種質粒中的單一識別位點，當有多個數據時取其平均值，用 λDNA 作為陽性對照（所有情況下切割它所需酶量均為 1 個單位）。